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定量吸光度分光光度法

对于学生和光谱仪的新用户而言，运用吸光度分光光度法必须先了解比尔-朗伯定律。无论是定量还是定性，我们都可以运用比尔-朗伯定律。前言吸光度分光光度法可定性识别“指纹”物质，或定量测量透明溶液中有色物质（发色基团）的浓度。一些情况下，需要明确知道未知物质的绝对吸光度或消光系数。另一些情况下，可以根据公式确定未知物相对于已知浓度标准溶液的浓度。在这两类情况下，吸光度的推导就叫比尔-朗伯定律。实验条件分光光度计测量吸光度的方法是将波长为 λ的平行光通过一块平面平行物质，然后测量该透过的光束，对于液体样品，我们可以选择盛放在比色皿中。由于一部分能量被样品中的分子吸收，样品的入射光（I0）的强度要高于透过样品的光（I）。结果透射率（T）（表示为百分比）是一个比率关系：不透明样品的透射率为0%，而透明样品的透射率为100%。若光路中有具有光吸收能力的分子，透射率将低于100%。与光相互作用的分子数量取决于光程（I）和分子浓度（C）。衰减效应也取决于分子吸收该波长光线的能力，表示为消光系数或摩尔吸收系数。吸光度（Aλ）是指光通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光通过溶液或物质后的透射光强度比值的并以10为底的对数。换算成浓度、光程与吸光度的关系如下：完全透明的样品的吸光度为0（T=100%），完全不透明的样品的吸光度为无穷大（T=0%）。 ε的数值取决于c的单位。 c的单位一般是摩尔浓度（摩尔/升），l的单位为厘米，那ε的单位（升/(摩尔·厘米）。结论空气/样品界面和样品/比色皿的界面的光反射以及溶液的光吸收都会减弱光强度。可分别定量分析这些因素，但通过将I0定义为通过空白样品或对照样品的光，可以消除这些因素的影响。要消除空白溶液吸光度的影响，有两种方法可供选择：可以先测量空白溶液的吸光度，然后从样品吸光度中减去这一数值，或将仪器设置为100%T或0吸光度单位后再开始测量。这与天平去皮重十分类似。影响比尔-朗伯定律效力的因素很多。通常通过检测一系列标准品的吸光度来确认某一发色基团的线性（见表1的发光团采样）。这一校准措施还能消除实验、设备和试剂批次造成的误差（诸如光程未知的比色皿）。

2018 - 03 - 13
吸光度知识课堂-发色基团特征吸收峰

生色团是指分子中含有的，能对光辐射产生吸收、具有跃迁的不饱和基团及其相关的化学键。某些有机化合物分子中存在含有不饱和键的基团，能够在紫外及可见光区域内（200～800nm）产生吸收，且吸收系数较大，这种吸收具有波长选择性，吸收某种波长（颜色）的光，而不吸收另外波长（颜色）的光，从而使物质显现颜色，所以称为生色团，又称发色团(chromophore)。分子吸收通常表现为n →π*和π→π*跃迁，因而吸收范围多在200～800nm之间。海洋光学的应用工程师通过近85,000台光谱仪的检测和使用，对分子中存在吸收的官能团和该官能团所表现的吸收波带进行了总结，如下表。发色基团官能团最大吸收波段（nm）吸收强度炔烃键-C≡C-175-1806000醛基-CHO210280-300Strong11-18氨基-NH21952800碳氮键C=N-1905000偶氮基-N=N-285-4003-25溴基-Br208300羰基C=O195270-285100018-30羧基-COOH200-21050-70双硫键-S-S-1942555500400酯类-COOR20550醚类-O-1851000烯烃键-C=C-1908000碘基-I260400硝酸根-ONO227012腈基-C≡N160-亚硝酸根- ONO220-230300-4001000200010硝基-NO2210Strong亚硝基-NO302100肟基-NOH1905000砜基-SO2-180-亚砜基S=O2101500硫代羰基C=S205Strong硫醚-S-19421546001600巯基-SH1951400苯环184204255467006900170联苯24620000萘2222753121120005600175蒽2523751990007900菲2512926600014000萘并萘27247318000012500并五苯31058530000012000吡啶1741952578000060001700喹啉2272703143700036002750异喹啉2182663178000040003500

2018 - 03 - 13
吸光度测量解决方案

如何根据您的应用选择不同的采样附件是至关重要的。这其中就包括您需要考虑您的样品是液体的还是气体的；样品的光学密度如何；是要原位测试，还是过程控制，或者是在一个反应腔室内。从应用出发进行附件筛选，海洋光学为您提供众多附件选择，从简单的实验室应用（比如比色皿和比色皿支架）到复杂的采样工具（比如透射探头和流动注射装置等等）。吸光度测量基于吸光度的简单实现与易使用，吸光度被广泛运用于液体和气体的光谱测量技术中。吸光度光谱可以对物质进行定量鉴别或者对物质进行指纹认证，亦或可以对溶液中的分子进行浓度定量分析。吸光度测量可以以多种形式呈现。或针对液体或对气体，而且还可以将该应用集成到工业应用环境和客户所关注的测试中。样品不再仅仅使用比色皿作为载体，流动池、浸入式探头、微量进样器、气体存储皿、微量比色皿等等都可以作为采样装置。使用模块化光谱仪，我们可以针对特定的吸光度测量来选择不同波长范围和分辨率的光谱仪，而且还能在实验室或者现场对整套光学测量装置进行快速、方便地更改。事实上，基于海洋光学强大的光谱仪、光源和采样附件的产品线和灵活易用的搭配，可以针对不同的吸光度试验搭配出N中选择。吸光度测量的附件选择如何为您的吸光度测量选择合适的采样附件？以下提供一些参考：测量使用环境与地点？更精确地说，什么样的附件能满足您的现场和实验室，并且方便易用？如果测试样品能很简单地使用比色皿或者试管进行测量，那选择就可以扩展到比色皿支架（图1）或者其他支架类产品。如果需要进行实时的原位测量，或者流动液体的测量，可以选择透射形浸入式探头（不同光程可选）（图2）或者流动池（图3）等等。图1 图2 图3 样品的性状：液体还是气体？由于气体的特性，我们要么选择高浓度样品，要么选择长光程容器进行测量。根据不同的样品，10cm光程的容器一般都足够了，比如CUV-UV-10（图4），或者使用准直透镜直接接触到样品中进行测试。图4 测试样品的光学密度如何？光学密度OD值直接影响您对测试样品不同光程容器的选择。光学密度越高，所需要的光程就越短。比如，SpecVette™作为高浓度样品的理想配件，它的光程...

2018 - 03 - 13

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